嚴格使用一次性細胞培養瓶

　　一次性細胞培養瓶蓋不應擰得太緊，以保證氣體交換。HEPES是一種非離子緩沖液，在pH 7.2-7.4范圍內具有較好的緩沖能力，但是非常昂貴，在高濃度時對一些細胞可能有毒。HEPES緩沖液可與低水平的碳酸鈉（0.34g/L）共用，以抵消因額外加入HEPES引起的滲透壓增加。在這種培養條件下，一次性細胞培養瓶的蓋子應擰緊，以防止培養液中所需的少量碳酸鹽散入空氣中。大多數培養液中含有酚紅作為pH指示劑，酸性培養液呈橙黃色，堿性培養液呈深紅色。

　　溫馨提示：請嚴格按照此步驟操作，否則可能會出現一次性細胞培養瓶中細胞生長空白區域，即所謂的“生長空洞”。多數用戶使用的不是的預包被一次性細胞培養瓶，而是普通的一次性細胞培養瓶或培養皿，其表面環境并不利于無血清培養環境下的間充質干細胞貼壁。37℃放置5-10分鐘，可讓培養基中的促貼壁物質更好地與一次性細胞培養瓶底部結合，使得間充質干細胞的貼壁能力增強，降低“生長空洞”出現的概率。

　　細胞消化：將一次性細胞培養瓶豎立放置，吸走培養基，如果培養基中的脫落細胞較多，說明細胞現在很容易脫落，只要加入1ml的PBS+EDTA(0.02%)，來回輕微晃動培養瓶直到細胞*脫落，加入10mlMEM(10%杭州四季青胎牛血清)，混勻，不能吹打，分裝2瓶，如果細胞沒長滿就脫落，則只需加入5mlMEM，不分裝。如果培養瓶中的細胞貼壁較牢固，培養基上清沒有細胞脫落碎片，且細胞長滿達到80%以上，吸走培養基，加入5ml的PBS+EDTA(0.02%)，迅速輕微晃動，豎立培養瓶，吸走，加入1ml0.05%胰酶，37度消化不超過3min，細胞*消化脫壁，取出加入10ml培養基輕微吸打混勻，分裝2瓶。