如何保持無菌，是每個細胞培養實驗室一直面對的難題。污染幾率增加的主要原因包括：操作技術不嚴格，試劑質量不達標，大氣中孢子計數增加，培養箱或操作臺使用和維護不當，污染了的冰箱和水浴鍋。因此，在細胞培養過程中，操作者不僅要嚴格遵守標準的操作程序，同時還要特別注意新產品、新品牌、以及設備的清潔維護。

　　細胞作為重要的實驗模型廣泛應用于各類生物實驗,幾乎所有科研實驗室中都需進行細胞培養。細胞培養過程中最大的威脅就是細胞污染,凡是混入細胞培養環境中,對細胞生存有害的成分和造成細胞不純的異物都應視為污染。細胞一旦遭到污染,所有的實驗結果都會變得毫無意義。因此,及時檢測并鑒定出所培養的細胞是否被污染至關重要。

　　污染來源

　　細胞培養實驗室要求保持無菌操作，避免微生物及其他有害因素的影響。細胞培養室要相對封閉，潔凈無塵，設有緩沖間。對實驗室進行定期清掃、紫外消毒是避免細胞培養過程中由于實驗室環境引起細胞污染的主要措施，此外，實驗室內不要放太多雜物，保持實驗室干燥，有利于降低因實驗室條件引起的細胞污染率。

　　細胞培養過程中實驗人員是否操作規范，是否嚴格遵守無菌工作流程，是細胞污染的一個主要因素。操作人員進培養室前，必須先洗手，在緩沖間換穿專用實驗服和拖鞋，嚴禁在實驗進行時頻繁出入培養室。實驗后應將實驗產生的廢物和廢液及時清理出培養室，并清潔無菌工作臺。

　　常見污染原因

　　1、細菌、真菌污染

　　細菌和真菌污染很容易被檢測,因為受到細菌、真菌污染的細胞,培養過程中培養基會出現肉眼可見的明顯特征。細菌污染會導致培養基出現渾濁、顏色改變以及pH值急劇變化,受污染的貼壁細胞在幾天內會逐漸脫壁死亡。真菌污染后的細胞生長速度變慢,培養基中會漂浮白色、淺黃色或黑色的小點。因此,通過觀察培養基的顏色、漂浮物、pH值或在顯微鏡下觀察細胞及其生長狀態,從而能初步判斷該細胞是否受細菌、真菌污染。也可以使用培養檢測法：將細胞培養物在各類培養基中適溫培養若干天后,觀察是否有細菌或真菌生長。

　　2、支原體污染

　　支原體污染會影響細胞的形態、功能、代謝、細胞膜、生長速率、誘導染色體畸變、細胞內信號傳導等各種細胞特性。受支原體污染的細胞在培養時培養基的pH值不會發生改變,也不會渾濁,因此,很難直接觀察出細胞是否受到污染。

　　常用的支原體檢測DNA熒光染色法：使用熒光染料DAPI或Hoechst33258染色，熒光染料能選擇性的結合細胞和支原體DNA的小溝,因此,在準備過程中,任何存在的DNA均會被染色。被支原體污染的細胞經染色后,細胞核外與細胞周圍可看到許多大小均一的熒光點。

　　3、霉菌污染

　　霉菌污染早期，應用PBS多次沖洗細胞，盡量將孢子洗掉，然后用兩性霉素處理。兩性霉素對細胞生長影響也很大，濃度過高可致細胞死亡，濃度過低時則不能抑制霉菌生長。

　　4、病毒污染

　　有關病毒污染的資料不多，但一般認為病毒污染不影響細胞培養，通過PCR技術可以檢測。不過病毒污染對生產疫苗是不安全的。因此，至今，潛在病毒是細胞大量生產和疫苗、干擾素等生物制品制作的難題。有研究顯示用伽馬射線可清除牛血清的大部分病毒，現如今值得期待的是下游工藝中除病毒過濾器的開發。

　　結合文獻報道和本人的實際經驗認為，在細胞培養過程中，潛在的污染途徑主要包括操作技術和環境，其中環境因素又包括了無菌試劑和材料、超凈工作臺、恒溫恒濕培養箱、水浴鍋和冰箱等。

　　一、操作技術

　　培養操作前——

　?、艂€人衛生：進入細胞培養室時應更換實驗室專用鞋或者穿鞋套；穿戴實驗服、口罩和手套，用消毒酒精（75%濃度的乙醇）擦拭雙手；如果操作者是長發，應扎于腦后。

　?、乒ぷ髋_準備：提前0.5~1h打開超凈臺的紫外燈進行消毒；用蘸有消毒酒精的紙巾擦拭超凈臺的臺面、擋板等。

　?、窃噭蕚洌簭睦洳厥一蚶鋬鍪胰〕鏊璧呐囵B基等試劑，于37℃水浴鍋中進行加熱；加熱后用消毒酒精擦拭瓶身，并立馬放入超凈工作臺內。

　　須注意的事項有：外套、書包等物品，易附著豐富的微生物，不應帶入細胞房。

　　培養操作中——

　?、排_面布置：按實驗需要和個人習慣，合理放置試劑、耗材、儀器等物品；點燃酒精燈后開始實驗操作。

　?、撇僮鳎嚎拷鹧孢M行實驗操作；試劑瓶經火焰旋轉灼燒后打開；挑選吸管，快速的縱向在火焰上來回移動并做180°旋轉；將試劑瓶向吸管傾斜，吸出所需的液體量；灼燒瓶頸后，重新蓋上蓋子；等所有操作完畢后，擰緊瓶蓋。

　　須注意的事項有：操作要準確、敏捷、有序；吸取溶液時，應專管專用，避免交叉污染；吸管管口要向下傾斜，以防止液體倒流進入移液器內發生污染；盡量減少細胞和培養基的敞口時間；已開口的試劑瓶盡可能的傾斜放置，防止下落微生物的污染；避免在敞口的細胞培養皿及培養皿蓋上方操作；不要面對工作臺或細胞培養箱講話或咳嗽，防止口腔微生物隨唾沫飛入而發生污染；若發生外溢，用蘸有消毒酒精的棉球及時擦去。

　　培養操作后

　?、耪恚簩⒃噭┓呕卦瓉淼拇鎯ξ恢茫徽砉ぷ髋_面，物歸原位，合理丟棄廢液和廢物。

　?、葡荆河孟揪凭潦门_面；打開超凈工作臺和細胞房的紫外燈，照射至少15min。

　　須注意的事項有：紫外燈開啟后，人不能進入，紫外線對眼睛和裸露的皮膚均有危害，若要進入，一定要先關閉紫外燈，待人離開后打開。

　　二、環境

　　如果操作者技術規范且操作嚴謹，那么當環境惡化時，也會導致污染風險的增加。進行細胞培養時，環境必須潔凈。

　　恒溫恒濕培養箱——細胞污染一個主要的途徑就是恒溫恒濕培養箱。恒溫恒濕培養箱，在培養細胞取出和放入的過程中，直接與空氣接觸，微生物會被夾帶進入；加之其內部濕度高、溫度適宜，特別有利于真菌繁殖。細胞培養瓶或培養皿，如果接觸了操作臺以外的地方，在放入培養箱前須經消毒酒精擦拭。但須注意的是，消毒酒精要經操作臺吹干，否則會導致培養箱內乙醇濃度升高，酒精會影響細胞的正常功能。

　　在很多情況下，細胞培養必須使用恒溫恒濕培養箱。為了有效的控制該污染途徑，可采取的措施有：①在加濕托盤內添加真菌抑制劑，如硫酸銅、十二烷基磺酸鈉，可抑制托盤內真菌的生長；亦或盛裝無菌的去離子水，并每周進行更換，托盤用消毒酒精或高溫滅菌的方法進行嚴格的清潔；②使用無毒抗真菌清潔劑對培養箱內外進行定期清潔，先用清潔劑、再用消毒酒精進行擦拭；為不留死角，清潔前應將培養箱內部能拆卸的部件都拆卸下來，清潔時也特別要注意不能拆卸的犄角旮旯處；③不正確的使用空氣過濾器，那將變為培養箱一個可怕的污染途徑，故須按使用說明定期更換空氣過濾器；④在使用過程中，任何溢出液必須立刻用消毒酒精清除干凈；⑤一旦發現培養物被污染，立馬清走。